какая система оценки антибиотикочувствительности используется в медицинской практике
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ:
МЕТОДЫ, РЕЗУЛЬТАТЫ, ОЦЕНКА
Решедько Галина Константиновна,
к.м.н., ассистент кафедры клинической фармакологии
Смоленской государственной медицинской академии
214019, г.Смоленск, ул.Крупской, 28, а/я № 5.
Тел.: +7(0812) 61 13 01, 61 13 27, Факс: (0812) 61 12 94,
E-Mail: galina@antibiotic.ru
Содержание
Резюме
В лекции рассмотрены основные методы определения чувствительности in vitro микроорганизмов к антимикробным препаратам (диско-диффузионный, Е-тестов, методы разведения). Отражены подходы к эмпирическому и этиотропному назначению антибиотиков в клинической практике. Обсуждены вопросы интерпретации результатов определения чувствительности с клинической и микробиологической точек зрения.
В настоящее время в клинической практике существуют два принципа назначения антибактериальных препаратов: эмпирическое и этиотропное. Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре, а также результатах контролируемых клинических исследований. Несомненным преимуществом эмпирического назначения химиопрепаратов является возможность быстрого начала терапии. Кроме того, при таком подходе исключаются затраты на проведение дополнительных исследований.
|
Однако при неэффективности проводимой антибактериальной терапии, при нозокомиальных инфекциях, когда затруднительно предположить возбудителя и его чувствительность к антибиотикам стремятся проводить этиотропную терапию. Этиотропное назначение антибиотиков предполагает не только выделение возбудителя инфекции из клинического материала, но и определение его чувствительности к антибиотикам. Получение корректных данных возможно только при грамотном выполнении всех звеньев бактериологического исследования: от взятия клинического материала, транспортировки его в бактериологическую лабораторию, идентификации возбудителя до определения его чувствительности к антибиотикам и интерпретации полученных результатов.
|
Методы определения чувствительности к антибиотикам
Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные и методы разведения.
Рисунок 1. Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом.
Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 2). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).
Рисунок 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.
Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.
Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.
Интерпретация результатов определения чувствительности
На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные (рис. 4). Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные концентрации (breakpoint) антибиотика (или пограничные значения диаметра зоны подавления роста микроорганизма).
Рисунок 4. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий в соответствии со значениями МПК.
Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.
Чувствительные микроорганизмы (susceptible)
Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.
При отсутствии достоверной клинической информации подразделение на категории чувствительности базируется на совместном учете данных, полученных in vitro, и фармакокинетики, т.е. на концентрациях антибиотика, достижимых в месте инфекции (или в сыворотке крови).
Резистентные микроорганизмы (resistant)
К резистентным (устойчивым) относят бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.
Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate)
Клинически промежуточную резистентность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванные такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.
С микробиологической точки зрения к бактериям с промежуточной резистентностью относят субпопуляцию, находящуюся в соответствии со значениями МПК или диаметра зон, между чувствительными и резистентными микроорганизмами. Иногда штаммы с промежуточной резистентностью и резистентные бактерии объединяют в одну категорию резистентных микроорганизмов.
Необходимо отметить, что клиническая интерпретация чувствительности бактерий к антибиотикам является условной, поскольку исход терапии не всегда зависит только от активности антибактериального препарата против возбудителя. Клиницистам известны случаи, когда при резистентности микроорганизмов, по данным исследования in vitro, получали хороший клинический эффект. И наоборот, при чувствительности возбудителя может наблюдаться неэффективность терапии.
В определенных клинических ситуациях, когда недостаточно результатов исследования чувствительности обычными методами, определяют минимальную бактерицидную концентрацию.
Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных. Частными случаями для определения МБК могут быть, например, бактериальный эндокардит, остеомиелит или генерализованные инфекции у пациентов с иммунодефицитными состояниями.
В заключение хотелось бы отметить, что на сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.
Таблица 1. Критерии интерпретации чувствительности бактерий
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ К АНТИБИОТИКАМ:
МЕТОДЫ, РЕЗУЛЬТАТЫ, ОЦЕНКА
Решедько Галина Константиновна,
к.м.н., ассистент кафедры клинической фармакологии
Смоленской государственной медицинской академии
214019, г.Смоленск, ул.Крупской, 28, а/я № 5.
Тел.: +7(0812) 61 13 01, 61 13 27, Факс: (0812) 61 12 94,
E-Mail: galina@antibiotic.ru
Содержание
Резюме
В лекции рассмотрены основные методы определения чувствительности in vitro микроорганизмов к антимикробным препаратам (диско-диффузионный, Е-тестов, методы разведения). Отражены подходы к эмпирическому и этиотропному назначению антибиотиков в клинической практике. Обсуждены вопросы интерпретации результатов определения чувствительности с клинической и микробиологической точек зрения.
В настоящее время в клинической практике существуют два принципа назначения антибактериальных препаратов: эмпирическое и этиотропное. Эмпирическое назначение антибиотиков основано на знаниях о природной чувствительности бактерий, эпидемиологических данных о резистентности микроорганизмов в регионе или стационаре, а также результатах контролируемых клинических исследований. Несомненным преимуществом эмпирического назначения химиопрепаратов является возможность быстрого начала терапии. Кроме того, при таком подходе исключаются затраты на проведение дополнительных исследований.
|
Однако при неэффективности проводимой антибактериальной терапии, при нозокомиальных инфекциях, когда затруднительно предположить возбудителя и его чувствительность к антибиотикам стремятся проводить этиотропную терапию. Этиотропное назначение антибиотиков предполагает не только выделение возбудителя инфекции из клинического материала, но и определение его чувствительности к антибиотикам. Получение корректных данных возможно только при грамотном выполнении всех звеньев бактериологического исследования: от взятия клинического материала, транспортировки его в бактериологическую лабораторию, идентификации возбудителя до определения его чувствительности к антибиотикам и интерпретации полученных результатов.
|
Методы определения чувствительности к антибиотикам
Методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам делятся на 2 группы: диффузионные и методы разведения.
Рисунок 1. Определение чувствительности микроорганизмов диско-диффузионным методом.
Определение чувствительности микроорганизма с помощью Е-теста проводится аналогично тестированию диско-диффузионным методом. Отличие состоит в том, что вместо диска с антибиотиком используют полоску Е-теста, содержащую градиент концентраций антибиотика от максимальной к минимальной (рис. 2). В месте пересечения эллипсовидной зоны подавления роста с полоской Е-теста получают значение минимальной подавляющей концентрации (МПК).
Рисунок 2. Определение чувствительности микроорганизмов с помощью Е-тестов.
Несомненным достоинством диффузионных методов является простота тестирования и доступность выполнения в любой бактериологической лаборатории. Однако с учетом высокой стоимости Е-тестов для рутинной работы обычно используют диско-диффузионный метод.
Рисунок 3. Определение значения МПК методом разведения в жидкой питательной среде.
Интерпретация результатов определения чувствительности
На основании получаемых количественных данных (диаметра зоны подавления роста антибиотика или значения МПК) микроорганизмы подразделяют на чувствительные, умеренно резистентные и резистентные (рис. 4). Для разграничения этих трех категорий чувствительности (или резистентности) между собой используют так называемые пограничные концентрации (breakpoint) антибиотика (или пограничные значения диаметра зоны подавления роста микроорганизма).
Рисунок 4. Интерпретация результатов определения чувствительности бактерий в соответствии со значениями МПК.
Существуют два подхода к интерпретации результатов определения чувствительности: микробиологический и клинический. Микробиологическая интерпретация основана на анализе распределения значений концентраций антибиотика, подавляющих жизнеспособность бактерий. Клиническая интерпретация основана на оценке эффективности антибактериальной терапии.
Чувствительные микроорганизмы (susceptible)
Клинически к чувствительным относят бактерии (с учетом параметров, полученных in vitro), если при лечении стандартными дозами антибиотика инфекций, вызываемых этими микроорганизмами, наблюдают хороший терапевтический эффект.
При отсутствии достоверной клинической информации подразделение на категории чувствительности базируется на совместном учете данных, полученных in vitro, и фармакокинетики, т.е. на концентрациях антибиотика, достижимых в месте инфекции (или в сыворотке крови).
Резистентные микроорганизмы (resistant)
К резистентным (устойчивым) относят бактерии, когда при лечении инфекции, вызванной этими микроорганизмами, нет эффекта от терапии даже при использовании максимальных доз антибиотика. Такие микроорганизмы имеют механизмы резистентности.
Микроорганизмы c промежуточной резистентностью (intermediate)
Клинически промежуточную резистентность у бактерий подразумевают в случае, если инфекция, вызванные такими штаммами, может иметь различный терапевтический исход. Однако лечение может быть успешным, если антибиотик используется в дозировке, превышающей стандартную, или инфекция локализуется в месте, где антибактериальный препарат накапливается в высоких концентрациях.
С микробиологической точки зрения к бактериям с промежуточной резистентностью относят субпопуляцию, находящуюся в соответствии со значениями МПК или диаметра зон, между чувствительными и резистентными микроорганизмами. Иногда штаммы с промежуточной резистентностью и резистентные бактерии объединяют в одну категорию резистентных микроорганизмов.
Необходимо отметить, что клиническая интерпретация чувствительности бактерий к антибиотикам является условной, поскольку исход терапии не всегда зависит только от активности антибактериального препарата против возбудителя. Клиницистам известны случаи, когда при резистентности микроорганизмов, по данным исследования in vitro, получали хороший клинический эффект. И наоборот, при чувствительности возбудителя может наблюдаться неэффективность терапии.
В определенных клинических ситуациях, когда недостаточно результатов исследования чувствительности обычными методами, определяют минимальную бактерицидную концентрацию.
Значение МБК используют при терапии антибиотиками, обладающими бактериостатическим действием, или при отсутствии эффекта от антибактериальной терапии у особой категории больных. Частными случаями для определения МБК могут быть, например, бактериальный эндокардит, остеомиелит или генерализованные инфекции у пациентов с иммунодефицитными состояниями.
В заключение хотелось бы отметить, что на сегодняшний день не существует методов, которые позволили бы с абсолютной достоверностью прогнозировать клинический эффект антибиотиков при лечении инфекционных болезней. Однако, данные результатов определения чувствительности могут служить хорошим ориентиром клиницистам для выбора и коррекции антибактериальной терапии.
Таблица 1. Критерии интерпретации чувствительности бактерий
Антибиотикограмма: Диско-диффузионный метод. Интерпретация результатов
| Авторы: Сидоренко С.В., Колупаев В.Е. Брошюра публикуется с незначительными сокращениями |
Введение
Антимикробная терапия сыграла решающую роль в лечении инфекционных заболеваний человека в ХХ веке, так как благодаря использованию антибиотиков существенно уменьшилась смертность людей от инфекции, сократились сроки клинических проявлений заболеваний и число постинфекционных осложнений. Со времени открытия пенициллина в 20-х года были разработаны и синтезированы сотни антимикробных препаратов, десятки из которых в настоящее время доступны для клинического применения.
Вместе с тем, использование антибиотиков не оказало существенного влияния на частоту появления и распространения инфекций, на что возлагались большие надежды в первые годы эры антимикробной терапии. Нерациональное применение, а порой, и злоупотребление противомикробными препаратами, способствовало эволюции микроорганизмов с развитием у них различных механизмов устойчивости к действию антибиотиков. Вследствие этого, участились случаи неудач при лечении инфекционных болезней антибиотиками.
Различают естественную (природную) и приобретенную устойчивость (резистентность) микроорганизма к действию антимикробного агента. Естественная устойчивость является видо- или родоспецифичной и является стабильным признаком. Приобретенная устойчивость вначале формируется у отдельных штаммов какого-либо вида или рода, а в дальнейшем возможно ее широкое как внутри-, так и межвидовое распространение.
Генетические механизмы формирования устойчивости связаны либо с мутациями в имеющихся генах микроорганизма, либо с приобретением микроорганизмом новой для него генетической информации в результате конъюгации, трансдукции или трансформации. Детерминанты резистентности могут на хромосомах, так и на плазмидах.
Известны пять основных биохимических механизмов устойчивости:
Активное выведение антибиотика из микробной клетки.
Появление все большего числа новых антибиотиков и увеличение числа штаммов с приобретенной резистентностью требует ужесточения требований к стандартизации существующих методов оценки антибиотикорезистентности и разработки новых подходов к интерпретации результатов. Наиболее принципиальные изменения в методологии оценки антибиотикорезистентности и интерпретации результатов связаны с разработкой:
Без учета перечисленных фактов в настоящее время невозможно получение достоверных результатов оценки антибиотикочувствительности и, соответственно, квалифицированное применение современных антибактериальных средств.
Основной целью исследований антибиотикорезистентности является выявление приобретенной устойчивости к антибактериальным препаратам у природно-чувствительных к ним микроорганизмов. Подтверждение наличия у микроорганизма природной чувствительности или устойчивости к антибиотикам не является целью практических исследований.
Проведение исследований по оценке антибиотикорезистентности (определение резистограммы микроорганизма) необходимо для решения двух основных задач:
1. Обоснования назначения оптимальной индивидуальной антибиотикотерапии для конкретного больного.
2. Обоснования эмпирической антибиотикотерапии для отдельных нозологических форм инфекционных болезней на основании данных эпидемиологического мониторинга за уровнем антибиотикорезистентности микроорганизмов, циркулирующих в конкретных регионах или учреждениях.
Исследованию подлежат как микроорганизмы, выделенные из патологического материала, полученного от больных, так и выделенные из объектов внешней среды.
Этапы проведения исследования по оценке антибиотикорезистентности приведены ниже, содержание каждого из этапов будет рассмотрено в соответствующих разделах.
1. Оценка целесообразности изучения антибиотикорезистентности выделенного микроорганизма (определение показания для проведения исследования).
2. Выбор методов проведения исследования и контроля качества
3. Выбор антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование, его проведение, интерпретация результатов и выдача рекомендаций по лечению
1. Определение показаний для проведения исследований
Исследования антибиотикорезистентности показаны, если уровень устойчивости микроорганизма к антибактериальным препаратам не может быть предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма.
Исследованию по оценке антибиотикорезистентности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева клинического образца, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры.
Исследовать в практических целях микроорганизмы, для которых методы изучения антибиотикорезистентности в настоящее время недостаточно стандартизованы или отсутствуют обоснованные критерии оценки, не рекомендуется. Данные, полученные при исследовании чувствительности, таких микроорганизмов не могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма не приведена в утвержденной инструкции по его применению. С крайней осторожностью следует также оценивать факты выявления резистентности у микроорганизмов, для которых этот феномен ранее не был описан в научной литературе. Полученные штаммы рекомендуется отправлять в референтные лаборатории и специализированные учреждения для проверки.
Определение показаний для оценки антибиотикорезистентности микроорганизмов является обязанностью врача-бактериолога.
Обязательному исследованию на антибиотикорезистентность подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека.
Следует уделять внимание изучению антибиотикорезистентности микроорганизмов, относящихся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной устойчивости.
Микроорганизмы, проявляющие универсальную чувствительность к каким-либо антибиотикам (случаев развития резистентности не описано) исследовать на антибиотикорезистентность в повседневной практике не целесообразно, например: Streptococcus pyogenes – все штаммы чувствительны к пенициллину.
2. Диско-диффузионный метод оценки антибиотикочувствительности
2.1. Принцип метода
Принцип диско-диффузионного метода (по Keurby-Bauer) основан на феномене ингибиции антибиотиком поверхностного, видимого роста микроорганизмов на плотной (агаровой) питательной среде. Градиент концентрации антибиотика в питательной среде создается в результате его диффузии из носителя (картонного диска). Диск с антибиотиком помещается на поверхность питательной среды немедленно после посева (инокуляции) культуры исследуемого микроорганизма. При этом практически одновременно начинаются два процесса: диффузия антибиотика из диска и рост микроорганизмов на поверхности среды. С практической точки зрения важно то, что от диска к периферии происходит движение “фронта” концентрации антибиотика, равной его МПК в отношении исследуемого микроорганизма.
Особенностью роста микроорганизмов на питательных средах является наличие лаг-фазы – периода времени, в течение которого происходит адаптация культуры к новой среде. По окончании лаг-фазы рост культуры исследуемого микроорганизма начинается в тех областях, где концентрация антибиотика еще не превысила минимальную подавляющую. Таким образом, чем длиннее лаг-фаза у данного микроорганизма, тем большим окажется диаметр зоны ингибиции роста вокруг диска с антибиотиком. Диско-диффузионный метод в настоящее время стандартизован только для “быстрорастущих” микроорганизмов (формирующих гомогенный сплошной рост – “газон” через 18 – 20 ч инкубации.
Учитывая закономерности зонообразования очевидно, что для получения с помощью диско-диффузионного метода воспроизводимых результатов необходима стандартизация всех этапов исследования.
2.2. Методика проведения исследования
2.2.1. Приготовление питательной среды Мюллера Хинтона
Агаровая среда Мюллера Хинтона представляет собой стандартную питательную среду соответствующую нормам ВОЗ.
на 1000 мл дистиллированной воды:
– Лиофилизат настоя, приготовленного из 300 гр. говяжьего мяса
– Гидролизат казеина: 17,5 г
– Кукурузный крахмал: 1,5 г
– Агар-агар: 10 г
– рН 7,3 ± 0,1 после автоклавирования
Содержание двухвалентных катионов
Концентрация тимидина • должна быть меньше 50 нг/л
Агар Мюллера Хинтона выпускается микробиологическими фирмами производителями (в частности фирмой bioMerieux*) в нескольких видах (см. Приложение 1) :
При использовании питательной среды, разлитой в чашки Петри в заводских условиях, необходимо лишь выполнять рекомендации изготовителя по условиям хранения и сроку годности.
При приготовлении питательной среды в лабораторных условиях необходимо руководствоваться инструкцией изготовителя, после чего разлить расплавленную среду в чашки Петри.
Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Глубина агарового слоя в чашке должна быть 4.0 мм, что достигается при внесении 25 – 30 мл расплавленного агара в чашку диаметром 100 мм или 60 – 70 мл в чашку диаметром 150 мм. Соблюдение указанных предосторожностей необходимо в связи с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.
После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. При использовании свежеприготовленных чашек перед инокуляцией их необходимо подсушить, что достигается инкубацией при 37°С с приоткрытой крышкой в течение 10 – 20 мин.
Хранить чашки можно запаянными в полиэтиленовые пакеты при +4 – +8°С, в течение 7 – 10 сут. При использовании чашек после хранения в холодильнике их также необходимо подсушить в течение 10 – 20 мин при 37°С с приоткрытой крышкой.
Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.
2.2.2. Контроль качества питательной среды
Наиболее приемлемым для практических лабораторий способом контроля качества питательных сред является оценка чувствительности референтных штаммов с последующим сравнением полученных результатов с паспортными данными штамма.
В первую очередь необходимо использовать штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Среду следует считать удовлетворительной по качеству, если диаметр зоны ингибиции вокруг диска, содержащего 10 мкг гентамицина находится в пределах 16 – 21 мм. Выбор гентамицина для контроля качества связан с тем, что аминогликозидные антибиотики наиболее чувствительны к колебаниям концентрации двухвалентных катионов.
Для контроля среды на наличие антагонистов сульфаниламидных препаратов и триметоприма рекомендуется использовать штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212. При величине зоны ингибиции вокруг диска, содержащего 1.25/23.75 мкг триметоприма/сульфаметоксазола 20 мм и более среду следует признать удовлетворительной по качеству.
Количественная оценка при интерпретация зон подавления роста, основанная на использовании агара Мюллера Хинтона, не всегда применима к другим средам, например, часто используемой среде АГВ.
2.2.3. Диски с антибиотиками
Диски выпускаются фирмами-производителями (в частности фирмой bioMerieux*) в стандартной упаковке (см. Приложение 1) с 50 дисками или в стандартной таре, содержащей 4, 10 или 18 упаковок. Упаковки удобны для пользователя, герметичны, содержат поглотитель влаги.
Диаметр дисков, согласно рекомендациям ВОЗ, составляет 6,35 мм. На каждый диск нанесена аббревиатура, состоящая из 1, 2 или 3 букв. Хранить диски необходимо в сухом месте при + 2-8°С
2.2.4. Приготовление материала для инокуляции и посев
Для приготовления инокулята используют 18 – 20-ти часовую агаровую или 5 – 6-ти часовую бульонную культуру исследуемого микроорганизма. Суспензию из агаровой культуры или бульонную культуру доводят до мутности стандарта 0.5 McFarland и разводят еще в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия (конечная концентрация 1 – 2 х 107 КОЕ/мл). Для стандартизации суспензии возможно также использовать спектрофотометр, руководствуясь паспортными данными прибора или инструкцией по его применению.
Приготовленный таким образом инокулят наносят в количестве 1 – 2 мл на поверхность чашки Петри с питательной средой, равномерно распределяют по поверхности покачиванием и удаляют избыток жидкости пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10 – 15 мин.
Однако более практичным способом инокуляции является использование коммерческих стерильных ватных тампонов. Тампон необходимо погрузить в суспензию микроорганизма, избыток влаги удаляют отжимая тампон о стенку пробирки. Инокуляцию на поверхность агаровой среды проводят штриховыми движениями, периодически поворачивая чашку Петри на 60°.
2.2.5. Аппликация дисков
Разместить диски с соответствующими антибиотиками на поверхности агара, выдерживая расстоянии 15 мм от края чашки и не менее 30 мм между дисками.
Расстояние между центрами дисков (30 мм) позволяет обычно избегать интерференции между антибиотиками, но иногда в антибиограмме может быть обнаружен синергизм или антагонизм. Так, расположенные на расстоянии больше 60 мм между центрами, диски с триметопримом и с сульфамидом определяют чувствительность каждый к своему препарату. При расположении их на более близком расстоянии наблюдается эффект синергизма при слиянии зон просветления. Синергизм (несимметричные зоны) могут также наблюдаться в случае устойчивости к одному или другому из компонентов.
Для обеспечения хорошей постоянной диффузии антибиотика плотно прижать каждый диск к поверхности агара.
Оптимизировать стадию аппликации можно с помощью диспенсеров (распределителей дисков), которые выпускают различные микробиологические фирмы.
2.2.6. Оценка результатов
После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска измеряют с точностью до 1 мм, предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем. При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на полную ингибицию видимого роста. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или увеличении, и едва заметный налет у края зоны. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции, в этом случае необходима повторная идентификация и повторение исследования на антибиотикорезистентность.
При оценке антибиотикорезистентности роящихся штаммов протея, зона задержки роста может быть затянута тонкой вуалеобразной пленкой, которая не мешает установлению границы зоны.
При оценке резистентности к сульфаниламидам и их комбинации с триметопримом границу зоны ингибиции роста следует учитывать на уровне ингибиции роста на 80%. Это связано с тем, что под действием этих препаратов перед полной ингибицией роста возможно завершение 1 – 2-х циклов пролиферации микроорганизма.
В отличие от описанного выше метода учета результатов, при оценке антибиотикорезистентности стафилококков в отношении оксациллина необходимо учитывать и самые мелкие колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции роста.
Для интерпретации полученных результатов используют таблицы, в которых приведены пограничные значения зон ингибиции роста, позволяющие отнести исследуемую культуру микроорганизма к одной из трех категорий: “чувствительный”, “промежуточный”, “устойчивый”.
1. При отнесении штамма к категории “чувствительный” предполагается, что лечение инфекционной болезни, вызванной данным микроорганизмом, соответствующим антибиотиком в обычных терапевтических дозах будет, скорее всего, успешным.
2. При отнесении штамма к категории “промежуточный” предполагается, что лечение инфекционной болезни, вызванной данным микроорганизмом, соответствующим антибиотиком может быть успешным лишь при использовании повышенных доз препарата или при локализации инфекции в тех локусах человеческого организма,где антибиотик способен концентрироваться в силу его фармакокинетических особенностей (моча).
3. При отнесении штамма к категории “резистентный” предполагается, что лечение инфекционной болезни, вызванной данным микроорганизмом, соответствующим антибиотиком даже в повышенных дозах будет, скорее всего, неудачным.
Поскольку диаметр зоны ингибиции роста исследуемого микроорганизма, получаемый при постановке диско-диффузионного метода в определенных пределах жестко связан с величиной МПК антибиотика, каждому пороговому значению МПК соответствует определенная пороговая величина диаметра зоны ингибиции роста.
Однако в некоторых случаях корреляции между величиной МПК и диаметром зоны ингибиции роста не наблюдается (бета-лактамные антибиотики и пневмококки), в такой ситуации для оценки чувствительности необходимо использовать метод серийных разведений, диско-диффузионный метод не приемлем.
Необходимо обратить внимание на то, что для различных микроорганизмов критерии чувствительности к одним и тем же антибиотикам могут различаются.
3. Рекомендации по подбору антибиотиков для включения в исследование различных микроорганизмов и критерии интерпретации результатов
3.1 Общие рекомендации
Основой для выбора антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование, являются данные о природной устойчивости или чувствительности отдельных микроорганизмов или их групп, о распространении среди них приобретенной резистентности, а также о клинической эффективности антибиотиков.
В исследование целесообразно включать антибактериальные препараты, обладающие природной активностью в отношении выделенных микроорганизмов и клинически подтвержденной эффективностью при соответствующих инфекциях.
Антибиотики разделены на две группы: подлежащие изучению в первую очередь (группа А) и дополнительные (группа В). Формирование стандартных наборов антибиотиков, используемых для изучения антибиотикорезистентности микроорганизмов (определения резистограмм) в конкретных учреждениях является задачей врача-бактериолога, для ее решения необходимо привлекать врачей клинических специальностей.
Кроме спектра микробиологической активности препаратов, необходимо учитывать фармакокинетические, токсикологические и экономические параметры, а также особенности тактики терапии в конкретном учреждении. Необходимо учитывать также локализацию и тяжесть инфекции, например, при тяжелых и крайне тяжелых генерализованных инфекциях нецелесообразно изучать устойчивость к пероральным антибактериальным препаратам, бактериостатикам.
3.2. Оценка антибиотикорезистентности Enterobacteriaceae
Представители семейства Enterobacteriaceae являются одними из ведущих этиологических агентов как внебольничных, так и нозокомиальных инфекций. Для них характерно крайнее разнообразие возможных механизмов резистентности к антибиотикам. Целесообразность формирования отдельного набора для изучения указанной группы микроорганизмов определяется тем, что спектр природной чувствительности к антибиотикам представителей семейства Enterobacteriaceae отличается от спектра чувствительности других таксономических других групп грамотрицательных микроорганизмов.
Набор для определения резистограммы представителей семейства Enterobacteriaceae следует формировать, учитывая тот факт, что их ориентировочная групповая идентификация достаточно легко осуществляется на основании оценки культуральных свойств (рост на селективных средах) и результатах оксидазного теста. Это позволяет в значительной части случаев проводить исследование с материалом, полученным после инкубации первичного посева.
Самостоятельные наборы антибиотиков следует использовать для определения резистограмм:
Необходимость такого разделения связана с особенностями фармакокинетики отдельных антибиотиков в желудочно-кишечном тракте и мочевыводящих путях, а также различиями в их клинической эффективности.
Из практических соображений набор антибиотиков для оценки резистентности возбудителей инфекций мочевыводящих путей целесообразно формировать с учетом этиологической роли стафилококков и энтерококков. Учитывая этот факт, принципы подбора препаратов для изучения резистентности возбудителей мочевыводящих путей будут рассмотрены отдельно.
3.2.1. Оценка антибиотикорезистентности Enterobacteriaceae: возбудителей гнойно-воспалительных заболеваний
А) Препараты первого ряда
Основу лечения гнойно-воспалительных заболеваний, вызываемых представителями семейства Enterobacteriaceae, в настоящее время составляют b-лактамные антибиотики. Однако для этих микроорганизмов характерно широкое распространение устойчивости, связанной с продукцией различных b-лактамаз (плазмидных широкого и расширенного спектров, а также хромосомных).
Препаратами альтернативными b-лактамам являются аминогликозиды и фторхинолоны.
В первую очередь в исследование необходимо включать:
Выбор цефалоспоринов I или II поколений должен определяться локальными данными об этиологической структуре инфекций и уровне антибиотикорезистентности их возбудителей. При изучении антибиотикорезистентности Enterobacteriaceae – возбудителей госпитальных инфекций целесообразность включения цефалоспоринов I – II поколений проблематична.
Б) Дополнительные препараты
Включение в набор для исследования дополнительных антибиотиков, прежде всего, определяется тяжестью и локализацией инфекции.
При подборе антибиотиков для лечения инфекций легкой и средней степеней тяжести в исследование целесообразно включать сульфаниламидные препараты, цефалоспорины для орального применения, тетрациклины.
В случае тяжелых, крайне тяжелых и, особенно, госпитальных инфекций в исследование целесообразно включать карбапенемные препараты, цефалоспорины IV поколения, уреидопенициллины, комбинированные препараты (типа цефоперазон/сульбактам и пиперациллин/тазобактам), несколько аминогликозидов.
Особое внимание следует уделять интерпретации результатов оценки антибиотикочувствительности. Полученные результаты необходимо сопоставлять с данными о природной чувствительности микроорганизмов и возможном распространении среди них приобретенной резистентности.
К цефалоспоринам I поколения из энтеробактерий природной чувствительностью обладают лишь E.coli, P. mirabilis. Несмотря на наличие у этих антибиотиков активности in vitro в отношении Salmonella spp. и Shigella spp. указанные антибиотики при лечении кишечных инфекций в клинике мало эффективны.
Цефалоспорины II поколения обладают более широким спектром активности за счет Klebsiella spp., активность в отношении микроорганизмов группы Enterobacter spp, Citrobacter spp., Serratia spp. невысокая и непостоянная.
Природная чувствительность представителей семейства Enterobacteriaceae, в отличие от псевдомонад, ко всем цефалоспоринам III поколения практически одинакова, наблюдается также выраженная перекрестная резистентность между отдельными представителями этой группы антибиотиков. Однако на практике встречаются ситуации, когда при использовании существующих критериев микроорганизм (чаще всего E. coli и Klebsiella spp.) следует оценивать как чувствительный к одним из цефалоспоринов III, но устойчивый к другим. Такой фенотип чаще всего связан с продукцией микроорганизмом БЛРС (b-лактамазы расширенного спектра). Штамм следует рассматривать как подозрительный на продукцию БЛРС также при следующих значениях диаметров зон ингибиции роста вокруг диска хотя бы с одним из цефалоспоринов III поколения: