Негативный сигнал на p16ink4a в клетках что это

Негативный сигнал на p16ink4a в клетках что это

Риск рака шейки матки является вторым по частоте онкологическим заболеванием, угрожающим жизни женщины. Несмотря на достижения в диагностике, лечении и исследованиях этого заболевания, смертность в развивающихся странах продолжает оставаться высокой. Так, в 2008 году было зарегистрировано 529000 новых случаев и 275000 смертей от рака шейки матки. Прошло более 40 лет со времени открытия возбудителя этого заболевания. В 1970-х Harold zur Hausen предположил наличие корреляции между инфицированностью ВПЧ и развитием неопластических процессов в шейке матки. Вирус обладает высоким сродством к сквамозным эпителиальным клеткам и легко инфицирует их. Поражение вирусом, тем не менее, зависит от взаимодействия нескольких факторов: онкогенов, генов восстановления ДНК и генов-супрессоров опухоли [5].

Важное значение в профилактике рака шейки матки имеют диагностические программы обследования женщин. Заболеваемость раком шейки матки в мире колеблется в значительных пределах, и зависит во многом от экономической составляющей. Так, в США заболеваемость раком шейки невысока, в 2016 году 12990 женщин заболели и 4120 умерли от этого заболевания. Анализ показывает, что причиной этого является применение современных диагностических технологий, так женщинам в возрасте 21–29 лет раз в 3 года проводится анализ, предусматривающий гистологическую оценку методом жидкостной цитологии [6].

Применение Рар теста в гинекологической практике явилось фактором, поднявшим диагностику рака шейки матки на новый уровень. Вместе с тем, заболеваемость и смертность от рака шейки матки остается высокой, несмотря на контроль с помощью Рар теста, что указывает на ограниченные возможности этого диагностического метода. Частыми причинами ложных результатов анализа являются гиперплазия клеток, воспалительная атипия и сквамозная метаплазия. Наличие этих факторов приводит к необходимости повторных исследований или проведению более травматичных процедур [1]. Рак шейки матки вызывается 14 типами вируса папилломы человека (ВПЧ), а типы 16 и 18 являются причиной заболевания в 70 % случаев. Известно, что ВПЧ инфекция определяет развитие рака шейки матки, однако иммунная система в большинстве случаев обеспечивает элиминацию вируса в течение одного или двух лет [3, 4].

Современные программы скрининга основаны на жидкостной цитологии, включающей забор пробы маленькой пластиковой щеткой в питательную жидкую среду с целью дальнейшего приготовления мазков. Цервикальная цитология зависит от получения хороших образцов и экспертной интерпретации микроскопической картины, что практически не выполнимо без соответствующего оборудования и подготовки.

Весьма перспективным тестом диагностики дисплазии и рака шейки матки может быть иммуноцитохимическое определение повышенной экспрессии гена-супрессора p16INK4a. В норме, кодируемый этим геном, белок p16INK4a блокирует вызываемую фактором роста стимуляцию деления клетки за счет угнетения циклин- зависимой киназы, что приводит к нарушению фосфорилирования белка ретинобластомы (БРБ). В этих условиях БРБ связывается с фактором транскрипции Е2F, блокирует его митотическую активность и останавливает деление клетки. Однако, при ВПЧ инфекции, встроенная в геном хозяина ДНК вируса начинает синтезировать два онкогена, Е6 и Е7. Онкоген Е7 связывается с белком ретинобластомы, препятствуя ингибированию E2F. Это приводит к неконтролируемому делению клетки и повышенному синтезу белка p16INK4a, что может быть зафиксировано с помощью цитоиммунохимическиой реакции [2]. Определение онкобелка p16INK4a позволяет вявить ранние стадии возникновения предрака и рака шейки матки. По эффективности этот тест является более релевантным, чем генотипирование ВПЧ или кольпоскопия.

Материалы и методы исследования

В сети медицинских клиник MedSwiss программой ДМС предусмотрено скрининговое исследование ранних пролиферативных процессов шейки матки. Эта программа включает:

1. Анализ данных жидкостной цитологии с поверхности шейки матки в режиме реального времени с применением компьютеризированной программы BD Focal Point и определение онкопротеина p16INK4a

2. ПЦР-тест на выявление основных 14 типов ВПЧ при первичном обследовании пациентки

3. Расширенное кольпоскопическое исследование на приеме у гинеколога.

В рамках этой программы при первичном осмотре у гинеколога пациенткам проводится Рар-тест в современной модификации, основанной на жидкостной цитологии. С этой целью одновременно из трех зон (поверхность шейки матки, из цервикального канала и зоны трансформации) берется биологический материал и помещается в виалу. Клеточный состав пробы обогащается, окрашивается на 2 стеклах и анализируется (на первом этапе одна проба) с помощью линейки приборов BD PreMate, BD SurePath, BD Focal Point.

Результаты исследования и их обсуждение

Результаты исследования, степень дисплазии клеток, представляются по Цитологической классификации ВОЗ (CIN I, CIN II и CIN III) и Цитологической классификации Бетесда (ASCUS, LSIL и HSIL). В случае обнаружения патологических изменений проводится исследование второй пробы на экспрессию белка p16INK4a. Одновременно всем пациенткам проводится анализ на выявление ВПЧ методом ПЦР диагностики (14 типов вируса). Неотъемлемым компонентом первичного обследования гинеколога является расширенная кольпоскопия.

Важным компонентом алгоритма является интегрированная оценка анализа жидкостной цитологии, наличия ВПЧ в анализе ПЦР и данных кольпоскопии. Действительно, часто интегративный анализ всех трех компонентов- положительная ПЦР, результаты жидкостной цитологии и кольпоскопии является определяющими при дальнейшем обследовании и ведении таких пациенток. Так, при положительном анализе ПЦР диагностики на наличие вируса высокого онкогенного риска (типы 31, 33,35, 39,45,51, 52, 56, 58, 59, 66, 68 и особенно 16 и 18) и характерных изменениях данных жидкостной цитологии возможно отсутствие визуальных изменений при кольпокопии.

В зависимости от инфицированности ВПЧ, результатов цитологического исследования и наличия белка p16INK4a нами разработаны были дорожные карты ведения пациенток, предусматривающие схемы от наблюдения до медикаментозного лечения и хирургической деструкции шейки матки [4].

Заключение

Таким образом, применение теста на белок p16INK4a позволяет повысить и специфичность, и чувствительность диагностики при дисплазии шейки матки, обеспечивая адекватное ведение пациенток с этой патологией [7].

Тактика ведения пациенток с патологией шейки матки. Лечение – медикаментозные методы лечения. Сокращения: ИМТ – иммуномодулирующая терапия; ПВТ – противовирусная терапия; ХДШМ – хирургическая деструкция шейки матки; ЖЦ – жидкостная цитология

Источник

Возможности ранней диагностики рака шейки матки

В статье обозначены проблемы в организации профилактики рака шейки матки и обсуждается диагностический алгоритм заболеваний шейки матки: стандартизованный забор клеточного материала с шейки матки; применение жидкостной цитологии; иммуноцитохимическое исследование онкомаркера р16. Предлагается алгоритм действий врача-гинеколога.

1. Актуальность проблемы

1. Отсутствие стандартизованного забора материала — неадекватно взятый материал с шейки матки приводит к ложно-негативным результатам;

2. Проблема ложноположительных цитологических заключений (когда мазок показывает дисплазию там, где ее нет на самом деле) не дискредитирует идею цитологического скрининга в целом, т.к. в большинстве случаев она разрешается ценой относительно малоинвазивных воздействий (биопсия шейки, повторная цитология после пробного лечения). Тем не менее, в каждом конкретном случае эта проблема создает ряд неудобств врачу и пациентке:

3. Даже если диагноз дисплазии верифицирован гистологически, вероятность перехода дисплазии в рак составляет менее 50%. Вместе с тем, как на клиническом, так и на микроскопическом уровне в настоящее время отсутствуют достоверные прогностические критерии дальнейшего биологического поведения дисплазии.

4. Если консенсус в лечебной тактике по отношению к тяжелой дисплазии и Са in situ уже достигнут, то при умеренной и легкой дисплазии многое зависит от мнения лечащего врача. Он должен сопоставить цитологическое заключение, клиническую и кольпоскопическую картину, возраст пациентки и т.п. и принять решение (в диапазоне от наблюдения без лечения до конусовидной эксцизии шейки матки). При этом зачастую врач стоит перед нелегким выбором, т.к. агрессивная тактика не всегда оправдана (особенно у молодых пациенток), а необоснованно выбранная выжидательная тактика грозит развитием рака. Ситуация усугубляется тем, что в этом вопросе нет ни единства во мнении среди врачей, ни определенных общепринятых стандартов.

5. Проблема ложноотрицательных цитологических заключений в налаженной системе цитологического скрининга нивелируется ежегодным повторением цитологического мазка. Однако при разовом цитологическом исследовании (когда пациентка до этого не была охвачена скринингом) в некоторых случаях требуются дополнительные гарантии отсутствия неопластического процесса.

6. Особо остро проблема ложноположительных и ложноотрицательных цитологических заключений стоит в отношении клеток железистого эпителия. В то время как аденокарцинома шейки может вообще не проявляться в цитологическом мазке, причиной выраженных изменений клеток железистого эпителия (даже с цитологической картиной аденокарциномы) могут являться реактивные процессы или эндометриоз.

7. Среди экспертов нет единого мнения по поводу тактики в отношении пациенток, которые инфицированы штаммами HPV высокого онкогенного риска, но нет дисплазии в цитологическом мазке. Мнение о том, что требуется лечить всех носителей и контактных лиц, сегодня уже дискредитировало себя, потому что большая часть носителей никогда не заболеет раком шейки матки.

Для разрешения данных проблем предлагается следующий диагностический алгоритм заболеваний шейки матки:

1. Стандартизованный забор клеточного материала с шейки матки;

2. Применение жидкостной цитологии;

3. Иммуноцитохимическое исследование онкомаркера р16ink4α.

Каждый из перечисленных пунктов обсуждается на последующих страницах статьи.

2. Забор материала

При отсутствии видимой патологии с шейки матки обязательно берется соскоб, для цитологического исследования.

Учитывая отсутствие видимой патологии, материал берется со всей поверхности шейки матки и из шеечного канала. В связи с тем, что рак чаще всего развивается в месте соединения плоского эпителия шейки матки с цилиндрическим эпителием цервикального канала, по периметру маточного зева (так называемая зона превращения), соскоб для забора материала при скрининге должен обязательно включать эту зону и эпителий шеечного канала.

Принципиальное значение при этом имеет использование специального инструмента, гарантирующего взятие материала со всех указанных зон и обеспечивающего информативность препарата. Использование приспособленных инструментов и средств недопустимо, так как это приводит к снижению эффективности скрининга, вплоть до нулевых результатов.

3. Жидкостная цитология

Более пятидесяти лет назад доктор Папаниколау, чьим именем впоследствии был назван метод (Рар-тест), разработал метод цитологического исследования клеток цервикального канала по мазку на стекле. Рар-тест широко используется в скрининговых исследованиях для диагностики рака шейки матки, предраковых и фоновых состояний. В странах северной Европы, где хорошо организованы скрининговые исследования, лечение предопухолевых состояний и ранних форм рака позволило уменьшить смертность от инвазивной цервикальной карциномы на 50 — 70 %. В настоящее время выявление группы риска при цитологическом исследовании цервикальных мазков во время профилактических осмотров и дальнейшего наблюдения позволяют уловить процесс озлокачествления на самых ранних стадиях.

Необходимой предпосылкой для точной оценки морфологии клеток в мазке является правильно сделанный и хорошо окрашенный мазок. Эффективность цитологической диагностики в значительной мере определяется качеством приготовления препаратов. В настоящее время все большее распространение получает новая технология приготовления цитопрепаратов, так называемая жидкостная цитология. Важной технологической особенностью метода жидкостной цитологии (ЖЦ), улучшающей качество исследования, является то, что исследуемый материал берется в специальный стабилизирующий раствор, который обеспечивает его сохранность без разрушения и потери клеток. При этом весь клеточный материал сохраняет без изменения свои морфологические и иммуноцитохимические свойства.

В последние пять лет в разных странах проводилось много исследований, в которых сравнивалась эффективность традиционной техники и ЖЦ, используя для подтверждения диагнозов гистологическую экспертизу, как «золотой стандарт» и оценку цитопрепаратов согласно классификации TBS (The Bethesda System. По обобщенным данным чувствительность традиционного метода колеблется в широком диапазоне значений: 34,5 — 89 %; а для метода ЖЦ имеет более стабильные значения: 71,4 — 95 %. Соответственно специфичность методов составляла: 36 — 76,9 % и 58 — 76,2 %. Авторы исследований резюмировали, что метод ЖЦ является более надежным лабораторным тестом, уменьшает количество ложноотрицательных результатов, уменьшает количество неудовлетворительных для анализа препаратов и время, необходимое цитологу для оценки препарата.

Исследование мазков по Папаниколау, полученных традиционным методом сбора материала, показывает, что не все, а только от 6,5 до 18 % взятых клеток наносятся на мазок. Кроме того, многие из этих клеток в результате плохого нанесения трудно или невозможно анализировать. Не вызывает сомнения, что традиционный метод анализа цитологического мазка имеет высокую диагностическую эффективность. Тем не менее, существует мнение, что метод имеет от 6 до 55 % ложноотрицательных результатов

Рисунок 1. Мазки полученные Г6 — традиционным способом, Р20 — при помощи жидкостной цитологии.

Причиной большинства (около 2/3) ложных результатов, снижающей качество работы лаборатории, является ошибка взятия или переноса материала для приготовления мазков. Материал для цитологического исследования получают с поверхности слизистой оболочки. Слизь, присутствующая во взятом материале, мешает перенести на мазок клетки, также материал невозможно равномерно перемешать. Материал может быть неравномерно распределен на стекле. Слишком толстый мазок является причиной получения неполноценного материала. При переносе материала на стекло традиционным способом клетки целого региона шейки матки могут не попасть в препарат. Подсушивание и потеря прилипших к инструменту клеток значительно уменьшает диагностическую информативность микропрепаратов (рис. 2). Метод ЖЦ позволяет исключить эти негативные факторы.

Рисунок 2. Мазки, полученные традиционным способом (а) и при помощи жидкостной цитологии (b).

Однако рутинное окрашивание мазков дает нам информацию о состоянии шейки матки на настоящий момент, но оно не способно оценить онкогенный потенциал изменений в тех случаях, когда не выявляется рак. Таким образом, применение только цитологического метода недостаточно для скрининга рака шейки матки.

4. Иммунноцитохимическое исследование онкомаркера р16

Рисунок 3. Негативная реакция на р16ink4α в нормальном плоском эпителии шейки матки

Рисунок 4. Позитивная реакция на р16ink4α (коричневое окрашивание ядер) в диспластически измененном эпителии шейки матки.

Было достоверно показано, что экспрессия р16 связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией (с внутриэпителиальными плоскоклеточными поражениями шейки матки как высокого, так и низкого Grade, LSIL и HSIL соответственно классификации ВОЗ), причем экспрессия р16 не встречалась в плоском эпителии без признаков дисплазии. В то же время, хотя отмечалась четкая корреляция обнаружения ДНК вируса папилломы человека с дисплазиями, имелось также большое количество ПЦР-позитивных на HPV случаев (с эписомальной локализацией HPV), в которых, при последующем гистологическом исследовании отсутствовал предрак и рак. Данное явление подтверждалось негативной иммуноцитохимической реакцией на р16ink4α в диспластических клетках (рис. 5).

Рисунок 5. Негативная иммуноцитохимическая реакциея на р16ink4α в диспластических клетках (указано стрелкой).

Таким образом, иммуноцитохимическое определение экспрессии р16 на мазках, приготовленных при помощи жидкостной цитологии, может позволить:

1. Достоверно оценивать потенциал дисплазии в отношении развития рака шейки матки и, соответственно, выбирать более консервативную или более агрессивную тактику лечения;

2. Уточнять заключения цитолога. Дополнительному исследованию на р16, с нашей точки зрения, подлежат все случаи атипической цитологии (кроме инвазивного рака шейки матки), неопределенные цитологические заключения (атипические клетки плоского эпителия неясного значения-ASCUS) и все изменения железистого эпителия.

3. Разрешать спорные вопросы при выявлении гинекологом высокоаномальной кольпоскопической картины, не сопровождающейся изменениями в цитологическом мазке;

4. Во многих случаях обоснованно отказаться от биопсии;

5. У большинства пациенток пожилого возраста с цитологической картиной дисплазии на фоне атрофического цервицита обоснованно избрать выжидательную тактику, отказавшись не только от лечения, но и от биопсий, и увеличить интервалы между диспансерными осмотрами. У небольшого числа р16-позитивных пациенток этой возрастной группы, напротив, обоснованно избрать более активную тактику;

6. Определять индивидуальную тактику в отношении пациенток, инфицированных штаммами вируса папилломы человека высокого онкогенного потенциала, если у них нет цитологических и кольпоскопических изменений. У женщин с позитивной ПЦР на HPV выделить группу пациенток, у которых уже инициирован канцерогенез в эпителии шейке матки, и направить на них необходимое лечебное воздействие. Соответственно в более многочисленной группе р16 негативных женщин необходимо продолжить мониторинг;

7. Усовершенствовать мониторинг пациенток, прошедших органосохраняющее лечение по поводу «тяжелой дисплазии» или «рака in situ», добавив определение р16 к рутинному цитологическому исследованию. Это позволит у пациенток наибольшего риска повысить чувствительность цитологического исследования и тестировать персистирующую папилломавирусную инфекцию до появления морфологических изменений.

5. Алгоритм действий врача-гинеколога

1. Забор материала мы рекомендуем проводить при помощи одноразовой цервикальной щеточки (cervix-brush, рис. 6): она вводится во влагалище под контролем глаза. Конус щеточки осторожно направляется в цервикальный канал. После введения в него конуса, щеточка прижимается к поверхности шейки и производится 5 полных круговых вращений — три по часовой стрелке и два — против часовой стрелки. Перед проведением данных манипуляций необходимо тщательно очистить шейку матки от слизи. Щеточку с материалом необходимо опустить в контейнер с жидкой транспортной средой и тщательно ополоснуть ее там. Жидкая среда и клеточная среда должны храниться в холодильнике при температуре от +2 до +8 о С. Клеточная суспензия стабильна в течение 10 дней.

Рисунок 6. Цервикальная щеточка.

2. Лабораторный этап занимает от 3 до 5 дней и включает в себя центрифугирование среды с получением монослойных мазков, рутинное окрашивание по Романовскому-Гимзе, иммуноцитохимическое исследование на р16ink4a.

3.Интерпретация результатов. Заключение включает в себя два подраздела: жидкостную цитологию и иммуноцитохимическое исследование на р16ink4a. Формулировка заключения жидкостной цитологии не отличается от традиционной, однако, его интерпретация должна проводиться в зависимости от выявление онкомаркера р16ink4a. Особенно это относится к дисплазиям шейки матки.

Источник

Негативный сигнал на p16ink4a в клетках что это

Иммуноцитохимическое исследование, позволяющее выявить экспрессию белка р16 (p16INK4a) на поверхности эпителиальных клеток. Белок р16 является биологическим маркером начала канцерогенеза – повышение его экспрессии наблюдается при предраковых изменениях и может рассматриваться как непрямой маркер активной онкогенной экспрессии ВПЧ высокого онкологического риска (выявляется при переходе ВПЧ из эписомальной формы в интегрированную). Определение экспрессии белка р16 позволяет с высокой точностью обнаружить риск развития рака шейки матки, своевременно поставить диагноз и назначить лечение. Определение уровня экспрессии позволяет выявить степень нарушения пролиферации, сопутствующей опухолевому росту, способность опухоли к инвазии и метастазированию.

Белок p16INK4a; иммуноцитохимическое исследование.

Синонимы английские

Оncoprotein p16INK4ain; immunocytochemical study.

Иммуноцитохимический метод + жидкостная цитология.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Аспират из полости матки.

Общая информация об исследовании

Было доказано, что экспрессия онкопротеина р16ink4a связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией (по цитологической классификации ВОЗ (CIN I, CIN II и CIN III) и цитологической классификации Бетесда (ASCUS, LSIL и HSIL), причем экспрессия онкопротеина р16ink4a не встречалась в плоском эпителии без признаков дисплазии. В норме кодируемый геном-супрессором белок p16INK4a блокирует вызываемую фактором роста стимуляцию деления клетки за счет угнетения циклин-зависимой киназы, что приводит к нарушению фосфорилирования белка ретинобластомы (БРБ). В этих условиях БРБ связывается с фактором транскрипции Е2F, блокирует его митотическую активность и останавливает деление клетки. Однако при ВПЧ инфекции встроенная в геном хозяина ДНК вируса начинает синтезировать два онкогена, Е6 и Е7. Онкоген Е7 связывается с белком ретинобластомы, препятствуя ингибированию E2F. Это приводит к неконтролируемому делению клетки и повышенному синтезу белка p16INK4a, что может быть зафиксировано с помощью цитоиммунохимической реакции.

В то же время, хотя отмечается четкая корреляция обнаружения ДНК вируса папилломы человека с дисплазиями, имеется также большое количество ПЦР-позитивных по HPV случаев (с эписомальной локализацией HPV), в которых при последующем гистологическом исследовании отсутствует предрак и рак. Это подтверждается негативной иммуноцитохимической реакцией на р16ink4a в диспластических клетках.

Материал для цитологического исследования получают с поверхности слизистой оболочки. Слизь, присутствующая во взятом материале, мешает перенести на мазок клетки, также материал невозможно равномерно перемешать. При переносе материала на стекло традиционным способом клетки области шейки матки могут не попасть в препарат, подсушивание и потеря прилипших к инструменту клеток значительно снижает диагностическую информативность микропрепаратов. Метод жидкостной цитологии позволяет исключить эти негативные факторы. Преимущество жидкостной цитологии состоит в том, что при взятии материала можно получить до 5-6 «серийных» (то есть одинаковых по клеточному составу) мазков. Это дает возможность применения дополнительных методов исследований.

Данное обследование может быть применено в диагностике поражения шейки матки, где это является наиболее частым и востребованным методом исследования. Оно может позволить:

Для чего используется исследование?

Когда назначается исследование?

Что означают результаты?

Референсные значения: отсутствие экспрессии белка р16 в клетках эпителия (негативная реакция).

Заключение включает в себя два подраздела: цитологическое описание и иммуноцитохимическое исследование на р16ink4a.

Цитологическое заключение интерпретируется в зависимости от выявления онкомаркера р16ink4a. В особенности это относится к дисплазиям шейки матки.

Белок р16(INK4a) осуществляет контроль разобщения комплекса E2F-Rb, препятствуя пролиферации клетки. В норме по механизму обратной связи синтез р16 сдерживается, таким образом, концентрация данного белка в нормальной клетке чрезвычайно мала, что проявляется негативной иммуноцитохимической реакцией.

Достоверно показано, что экспрессия р16 связана с низкой, умеренной и тяжелой дисплазией, причем экспрессия р16 практически не встречается в плоском эпителии без признаков дисплазии (0-2% случаев).

Экспрессия белка р16 нарастает с увеличением степени дисплазии и выявляется:

Кто назначает исследование?

47 Определение предиктора изменений эндометрия PTEN, Ki67

10 Human Papillomavirus высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59 типы), ДНК генотипирование [реал-тайм ПЦР]

Источник