Неструктурные белки вируса ящура что это значит
Неструктурные белки вируса ящура что это значит
Ящур — типичный зооноз, острая инфекционная болезнь, вызывающаяся фильтрующимся вирусом, передающаяся человеку от больных животных, характеризующаяся появлением пузырьков и эрозий на слизистой ротовой полости (афтозный стоматит), а также на коже кистей и
Ящур — типичный зооноз, острая инфекционная болезнь, вызывающаяся фильтрующимся вирусом, передающаяся человеку от больных животных, характеризующаяся появлением пузырьков и эрозий на слизистой ротовой полости (афтозный стоматит), а также на коже кистей и стоп.
Возбудитель ящура — фильтрующийся ультрамикроскопический вирус относится к семейству Picornoviridae. Вирус ящура характеризуется высокой изменчивостью как в лабораторных, так и в естественных условиях.
Ящур издавна встречается во всех частях земного шара, главным образом в сельскохозяйственных странах. Первые сообщения научного характера о ящуре у людей были опубликованы в Норвегии в 1764 году Сагаром, который наблюдал более 1500 случаев ящура (афтозной ящурной лихорадки).
Вирус устойчив во внешней среде. В молоке он сохраняется до 25–30 ч (в условиях холодильника — до 10 дней), в масле — до 2 мес, в колбасах и солони-не — до 50 дней, в отрубях — от 2 до 5 мес, в высохшей слюне (на шерсти животных, на одежде) — от 1 до 3 мес. В замороженных тушах вирус сохраняется до 687 дней. Ультрафиолетовые (солнечные) лучи и кипячение (в течение 5 мин) инактивируют вирус.
Резервуаром и источником инфекции являются больные животные, особенно крупный рогатый скот, а также свиньи, овцы и козы. Отмечена восприимчивость к ящуру и диких животных: лосей, косуль, северных оленей, сайгаков и др.
Особенно тяжело болеют молодые животные, среди которых отмечается большая летальность. Кроме перечисленных выше животных к ящуру восприимчивы верблюды. Изредка ящуром болеют лошади, собаки, кошки. Переносчиками могут оказаться восприимчивые к этой болезни грызуны (суслики, крысы, мыши), а также некоторые птицы (сами не болеющие, но выделяющие вирус, попавший с кормом, через кишечник) и овод. Животные заражаются при взаимном контакте на пастбищах, в коровниках и хлевах. Выделяясь из организма больных животных со слюной, молоком, навозом, мочой, содержимым пузырьков, вирус ящура попадает на подстилки, корм, спецодежду обслуживающего персонала, где может длительно сохраняться.
У животных, больных ящуром, обычно имеются характерные афтозные высыпания пузырьков и пузырей (позже изъязвляющихся) на слизистых рта, носа, десен, на языке, губах, в межкопытных щелях, реже у рогов («рыльно-копытная» болезнь). Вымя коров покрывается сыпью, что не лишено отчасти эпидемиологического значения, хотя само молоко становится заразным до появления афт и содержит вирус в течение 10–12 дней от начала болезни. У переболевших животных отмечается вирусоносительство, которое может не сопровождаться клиническими проявлениями. В подавляющем большинстве случаев с 10–12-го дня болезни выделение вируса прекращается. У крупного рогатого скота может наблюдаться так называемая злокачественная форма ящура, примерно в 60% случаев заканчивающаяся смертью через 1–1,5 сут от начала болезни. Животные, переболевшие ящуром, приобретают иммунитет на срок до 1,5 лет.
Человек заражается ящуром при употреблении сырого молока (больше 60% случаев) от больных животных (коров, коз), реже — при употреблении мяса вынужденно забитых больных животных. При контакте с больными животными заражение людей происходит в 30% случаев. Риску заражения подвергаются лица некоторых профессий: доярки, скотницы, телятницы, пастухи, работники мясокомбинатов и боен, ветеринары и зоотехники.
В организм человека вирус ящура попадает через мельчайшие повреждения кожи, а также через слизистые оболочки глаз, носа, рта и желудочно-кишечного тракта. Заражение может произойти также аэрогенным путем при вдыхании воздуха, в котором находятся частицы вируса. Наиболее восприимчивы к ящуру дети.
Возможны механический перенос вируса ящура обслуживающим и ветеринарно-техническим персоналом (на обуви, одежде, руках) и инфицирование здоровых животных.
Доказана возможность заражения здоровых животных от больного человека.
Крупные вспышки этой болезни в нашей стране отмечались в 1941–1943, 1952–1953 и в 1965 гг. В 2000–2001 гг. возник очаг ящура в Англии, Нидерландах с угрозой распространения инфекции в других европейских странах.
Вспышки ящура среди домашних животных зарегистрированы в Казахстане (село Мирное Карагандинской обл.), Китае, КНДР, Южной Корее, во Вьетнаме.
Постоянно неблагоприятная эпидемиологическая обстановка по ящуру наблюдается в таких странах, как Иран, Турция, Афганистан.
Проникнув в организм человека, вирус ящура начинает размножаться в клетках эпителия слизистой оболочки или эпидермальных клетках кожи. При этом возникает воспалительная реакция в виде пузырьков, заполненных серозным содержимым (первичный аффект), что дало возможность некоторым авторам определить ящур как эктодерматоз (эпителиоз).
В дальнейшем вирус из мест первичной репродукции попадает в кровь, распространяясь по всему организму (генерализация процесса), что клинически проявляется симптомами интоксикации (лихорадка, головная боль и т. д.).
Диссеминация вируса сопровождается поражением слизистых оболочек полости рта, языка, носа, уретры и кожи кистей рук, особенно около ногтей, в межпальцевых складках. Образуются так называемые вторичные афты и поражения кожи в виде пузырьков — везикул. Специфические афты могут быть также на слизистых желудка, кишечника и половых органов. Генерализация инфекции изредка сопровождается поражением миокарда.
Перенесенная болезнь оставляет прочный, но не продолжительный (1–1,5 года) видоспецифический иммунитет.
Инкубационный период длится от 2 до 12 сут (чаще 3–8 дней). В подавляющем большинстве случаев ящур начинается остро, внезапно, хотя возможно и постепенное развитие заболевания. Появляются сильный озноб, головная боль, недомогание, боли в мышцах, особенно в области поясницы. Аппетит резко снижается. Температура тела быстро повышается до 38–40°C и сохраняется на довольно высоком уровне в течение 5–6 дней. Спустя 1–2 дня после начала болезни отмечаются воспалительные изменения слизистой ротовой полости (чувство жжения во рту, болезненность при жевании, слюнотечение). В процесс вовлекаются слизистые губ, десен, щек, гортани. Язык отечен. В это же время развивается конъюнктивит (иногда односторонний), появляются рези при мочеиспускании (из-за развития уретрита). Через 1–2 дня после этого при осмотре полости рта на слизистых и особенно на краях и кончике языка можно обнаружить маленькие пузырьки (величиной от пшеничного до чечевичного зерна) с прозрачным, а затем мутно-желтоватым содержимым. Пузырьков иногда так много, что они густо располагаются на слизистой рта, включая десны и небо. Уже через сутки-двое пузырьки самостоятельно лопаются, а на их месте обнаруживаются болезненные, неправильной формы ярко-красные поверхностные изъязвления (афты), иногда сливающиеся между собой. После вскрытия пузырьков температура, как правило, несколько снижается, однако самочувствие больных ухудшается. Речь и глотание затруднены, резко повышается саливация, губы и язык отечны, покрыты налетом и корками. Припухают и становятся болезненными регионарные лимфоузлы. Пузырьки, а затем язвочки могут появиться на слизистой оболочке носа, задней стенки глотки, влагалища, уретры, конъюнктивах. Характерны склоненная поза больного и необходимость прибегать к помощи полотенца из-за буквально струящихся потоков слюны, а также страдальческое выражение лица и раздражительность.
Помимо поражения слизистых у большинства больных везикулы появляются на коже, причем для ящура наиболее характерна их локализация между пальцами рук и ног, а также у основания ногтей. Пузырьки полиморфны, единичные из них по величине могут доходить до буллы. Кроме того, иногда отмечаются эритематозные пятна не только на конечностях, но и на туловище. Кисти и стопы в некоторых случаях припухают, в их области больные ощущают жжение, мурашки, зуд. Пациенты также при этом могут находиться в вынужденной позе: растопыренные пальцы, согнутые руки и шея, сведенные ноги. У части больных ногти впоследствии выпадают.
Период высыпания длится примерно неделю. Афты на слизистой оболочке ротовой полости, губ, языке заживают обычно быстро, в течение 3–5 дней, не оставляя после себя рубцов. Температура снижается до нормальных показателей, и наступает фаза выздоровления, продолжающаяся в среднем 10–15 дней. Однако у ряда больных может появиться повторное высыпание пузырьков на слизистых и коже, затягивающее лечение болезни на несколько месяцев. В тяжело протекающих случаях возможно появление геморрагической сыпи на шее, груди, спине.
Изменений со стороны внутренних органов при неосложненном ящуре обычно не отмечается. У детей болезнь может сопровождаться развитием гастроэнтерита.
Гемограмма при ящуре в разгаре заболевания характеризуется эозинофилией, а у части больных отмечается лейкопения.
Помимо клинически выраженных форм ящура наблюдаются также стертые формы без клинических проявлений, которые могут проявляться в виде малохарактерного стоматита и общего недомогания либо характеризоваться умеренной головной болью, недомоганием, сопровождающимся появлением в межпальцевых складках характерных везикул, которые через 1–2 дня вскрываются и быстро заживают. Бессимптомные формы протекают без каких-либо клинических проявлений.
При хроническом затяжном течении болезни высыпания на коже имеют вид не пузырьков, а бугорков, которые рассасываются, а кожа над ними не шелушится.
Общепринятой клинической классификации ящура нет. Обычно выделяются следующие клинические формы ящура:
В целом ящур протекает благоприятно. Болезнь обычно заканчивается выздоровлением, наступающим через 2–3 нед.
Очень редко болезнь осложняется миокардитом, а из-за присоединения вторичной бактериальной микрофлоры — пневмонией и даже сепсисом. Вирусоносительство при ящуре может продолжаться до 120–150 дней после перенесенного заболевания, представляя угрозу новой вспышки среди животных.
Диагноз ящура основывается на следующих данных:
Из серологических методов для диагностики ящура применяются РСК и РПГА, с помощью которых выявляются антитела к вирусу ящура в сыворотке крови больных. В последнее время для быстрой диагностики болезни возможно использование ПЦР.
Биопроба проводится на морских свинках, которых заражают методом скарификации или путем внутрикожного введения исследуемого материала в подошвенную поверхность задних лапок. При наличии вируса через 24–36 ч на месте заражения образуются первичные везикулы, которые вскрываются и превращаются в эрозии. Спустя еще 1–3 дня развиваются вторичные везикулы на языке и на подошвах передних лапок.
Следует помнить, что имеются также атипичные формы ящура, о которых было сказано ранее.
Дифференциальный диагноз ящура следует проводить в первую очередь с афтозным стоматитом, который встречается чаще у маленьких детей. При афтозном стоматите отсутствуют лихорадка, симптомы интоксикации, обильная саливация и поражение кожи. Поражается только слизистая ротовой полости, язвы более глубокие и никогда не сливаются между собой, а дно их покрыто беловатым налетом. В крови не отмечается эозинофилии.
Для ветряной оспы, с которой в ряде случаев приходится дифференцировать ящур, характерны:
Ящур также необходимо дифференцировать с энтеровирусными инфекциями — герпангиной и энтеровирусной экзантемой (бостонской или эпидемической экзантемой).
При герпангине с первых же дней болезни на слизистой оболочке мягкого неба, языка и особенно дужек появляются сначала мелкие красные папулы, затем характерные везикулы (величина их достигает булавочной головки), наполненные прозрачным содержимым и не сливающиеся между собой даже при обильном высыпании (от 5–6 до 30). Пузырьки вскрываются через 1–2 дня, оставляя после себя небольшие, быстро заживающие эрозии. Самочувствие больных при этом меняется мало.
При энтеровирусной экзантеме лихорадочное состояние дополняется появлением сыпи на коже лица, туловища и конечностей. Сыпь краснухоподобная, но может быть макулопапулезной, петехиальной, ульцерозной (язвенной), булезной. Иногда сыпь появляется на пике лихорадки, но чаще в период ее спада (лихорадка длится 1–8 дней) и исчезает через 1–2 сут без шелушения и пигментации. Пятнистая экзантема может появиться и на слизистой оболочке рта. Исчезает в те же сроки, что и сыпь на коже. В острый период болезни нередко возникают фарингит и конъюнктивит.
Для дифференциальной диагностики ящура и вышеописанных форм энтеровирусной инфекции имеют значение эпиданамнез и лабораторные исследования.
Ящур иногда приходится дифференцировать с геморрагической лихорадкой Ласса. Болезнь в отличие от ящура начинается постепенно — с озноба, жара, умеренных головных болей. Температура достигает высоких цифр (39–40°С) к 3–5-му дню болезни. Характерно поражение зева — язвенно-некротические изменения на миндалинах и мягком небе. На 5-й день появляются кашель, боль в груди и животе, тошнота, рвота и обильный водянистый стул. Отмечаются гиперемия лица, шеи и генерализованная лимфаденопатия. В конце 1-й нед появляется смешанная (петехии, розеолы, макулы, папулы) сыпь на коже лица, туловища и конечностей. Умеренно увеличивается печень. У больных развивается геморрагический синдром: кровохарканье, кровоизлияния на коже и слизистых оболочках, желудочные и кишечные кровотечения. Артериальное давление падает, снижается диурез. Может развиться инфекционно-токсический шок.
Установлению диагноза лихорадки Ласса помогают правильно собранный эпиданамнез (болезнь эпидемична для стран Западной и Центральной Африки), данныe исследования крови (лейкопения, затем лейкоцитоз, нейтрофилез, увеличение СОЭ), мочи (протеинурия, микрогематурия, цилиндрурия, гиперазотемия), а также выделение вируса серологическими методами (РСК, РНИФ), ПЦР.
Больным ящуром независимо от тяжести заболевания необходимо проходить лечение в условиях стационара, где они должны находиться не менее 14 дней от начала болезни до полного клинического выздоровления, заживления язв на слизистых оболочках и коже.
Антибиотики при этой болезни неэффективны. Они принимаются только в случае присоединения вторичной бактериальной инфекции. Некоторый эффект получен при использовании для лечения ящура препаратов интерферона и индукторов интерферона, обладающих противовирусной активностью.
Благоприятное влияние на организм больного ящуром оказывают ингибиторы протеолиза (контрикал, гордокс, трасилол) и антиоксиданты (эмоксипин, мексидол), особенно при сочетанном введении в лимфатические сосуды или лимфатические узлы.
Для снижения степени токсемии больным ящуром необходимо проведение детоксикационной терапии (гемодез, реополиглюкин, кристаллоиды).
Важное значение имеют тщательный уход за больными и организация питания (дробное питание жидкой или полужидкой пищей). Больному даются молоко, сливки, кефир, жидкие каши, слизистые супы и т. д. Кормить пациентов нужно малыми дозами 6–7 раз в сут. В тяжелых случаях, при невозможности приема пищи пациентом, приходится прибегать к зондированному питанию. Перед приемом пищи для снижения интенсивности болевых ощущений из-за наличия афт в ротовой полости больному ящуром за 20–30 мин до еды назначается анестезин в порошке (0,1 г). Для полоскания полости рта применяют 3%-ный раствор перекиси водорода, 0,01–0,1%-ный раствор перманганата калия, а также настой ромашки. Для уменьшения болевых ощущений используют также мази, содержащие анестезин и новокаин. В период заживления афт их рекомендуют смазывать маслом шиповника, облепихи или каротолином. При поражении глаз применяют 30%-ный раствор альбуцида.
Необходимо также назначение витаминов, а в тяжелых случаях — сердечно-сосудистых средств.
Для предупреждения распространения ящура среди людей необходимо ликвидировать его среди животных, что достигается установлением строгих карантинных мероприятий (ограждения, дезинфекция транспорта, выезжающего за пределы очага, и т. д.). Лица, соприкасающиеся с больными животными, должны работать в спецодежде. Молоко перед употреблением необходимо кипятить не менее 5 мин, а мясо больных животных может быть использовано только после тщательной термической обработки. Оборудуются помещения для обеззараживания молока, его переработки и временного хранения. Людям, работающим с больными ящуром животными, запрещается пить воду, принимать пищу или курить в очаге инфекции. Не допускаются к работе в неблагоприятных по ящуру хозяйствах беременные женщины, подростки и лица с микротравмами рук.
Проводится вакцинация здоровых животных. В некоторых случаях при подозрении на ящур стадо животных подлежит полному уничтожению.
А. Е. Кудрявцев, кандидат медицинских наук
Г. К. Аликеева, кандидат медицинских наук
МГМСУ, Москва
Пептид 2A: два в одном
Пептид 2A: два в одном
Схема генома вируса ящура, а также расположение и аминокислотная последовательность пептида 2A. На правом конце 2A в вирусном белке находится сайт первичного процессинга (разделения длинного полипептида вируса на более короткие молекулы). Пептид 2A, в отличие от «настоящих» протеаз Lpro и 3Cpro, также фрагментирующих первичный полипептид (показано пробелами), работает только во время белкового синтеза, прямо внутри рибосомы.
Автор
Редакторы
Статья на конкурс «био/мол/текст»: В статье рассказывается о механизме действия пептида 2A из вируса ящура, при вставке генетической последовательности которого между последовательностями двух других белков, в любой эукариотической клетке произойдет разделение синтезируемой белковой цепочки на две — прямо во время синтеза полипептида внутри рибосомы. Это свойство 2A применяется в биотехнологии для получения нескольких белков с одной РНК. В наших экспериментах показано, что в таком «расщеплении» принимают участие факторы терминации трансляции.
Конкурс «био/мол/текст»-2011
Эта работа заняла первое место в номинации «Своя работа» конкурса «био/мол/текст»-2011.
Скачет зайка по лужайке:
Прыг да скок, прыг да скок,
Ну, а клетка в это время
Синтезирует белок.
Биотеатр Белгосуниверситета
Биосинтез белка
В общих чертах, синтез белка происходит одинаково во всех живых клетках, начиная от бактерий и заканчивая человеком. Для начала нужна инструкция, молекула РНК.
Малая субъединица рибосомы — молекулярной машины для синтеза белка — соединяется с большой субъединицей на стартовой тройке нуклеотидов информационной, или матричной РНК (мРНК) — кодоне AUG. Синтез происходит на интерфейсе между большой и малой субъединицами, где протянута нитка мРНК (рис. 1).
Рисунок 1. Схема синтеза белка. Малая субъединица рибосомы (2) присоединяется к большой (3) и начинает синтез белка (растущая фиолетовая линия) с кодона AUG (1). На стоп-кодоне UAG факторы терминации гидролизуют последнюю тРНК, белок высвобождается, субъединицы разъединяются.
Первая транспортная РНК (тРНК), к которой присоединена аминокислота метионин, узнав «свои» три нуклеотида (кодон) на мРНК, присоединяется к А-сайту рибосомы (рис. 2). Вторая тРНК узнает следующий кодон, который находится в Р-сайте рибосомы, и рибосома катализирует образование пептидной связи между двумя аминокислотами, находящимися «по соседству». После этого рибосома сдвигается на один кодон, первая тРНК отсоединяется от рибосомы, следующая тРНК с присоединенной к ней аминокислотой узнает следующий кодон и присоединяется к Р-сайту. И так далее — быстро, четко, с несколькими проверками качества, которые позволяют убедиться, что правильная аминокислота будет в правильном месте, и что белок будет работать.
Рисунок 2. Схематическое строение рибосомы и ее «рабочий цикл». Рибосома пошагово синтезирует белок, пока не доходит стоп-кодона, когда вместо тРНК в А-сайт присоединяются факторы терминации, катализирующие расщепление связи между белком и последней тРНК.
Синтезируемая цепочка аминокислот направляется в рибосомальный тоннель в большой субъединице, словно нитка через игольное ушкó. До того, как вновь синтезированный полипептид выйдет за пределы рибосомы во внутреннее пространство клетки, полипептидная цепочка будет в длину минимум 30 аминокислот. Белок удлиняется до тех пор, пока в конце мРНК рибосома не встретит кодон, который не узнаёт ни одна тРНК — стоп-кодон. Как титры «The End» означают конец фильма, так и стоп-кодон означает конец синтеза белка.
Процесс прекращения синтеза белка, или терминации, как это ни странно, устроен проще у высших организмов, чем у бактерий. И у человека, и у братьев наших меньших — дрожжей — прекращение синтеза белка зависит от двух белков — факторов терминации 1 (ФТ1) и 3 (ФТ3) (ФТ2 у высших организмов отсутствует — история биологии, как любая история, штука нелогичная). По форме напоминающий букву Г, ФТ1 похож на тРНК. В основании «Г» расположены аминокислоты, которые узнают стоп-кодон, горизонтальная ручка «Г» участвует в гидролизе полипетидной цепочки, освобождая её от последней тРНК. В то время, как ФТ1 служит катализатором, ФТ3 поставляет энергию для гидролиза. Ошибочная терминация, когда факторы терминации присоединяются в середине белка, происходит крайне редко — один раз на один миллион присоединённых аминокислот.
Пептид из вируса рогов и копыт
Этой системой пользуются не только живые организмы, но и нечто не совсем живое — вирусы. Вирусы используют аппарат синтеза белка клетки, которую они заразили, для производства своих белков. Однако они, как и вирусы в компьютере, заставляют рибосомы выпускать несвойственную им продукцию.
Пожалуй, один из самых известных вирусов — вирус ящура, который заражает крупный рогатый скот и человека. Эпидемия ящура в 2007 году нанесла многомиллиардный ущерб британской экономике, а такие эпидемии случаются регулярно.
«Программа» вируса ящура заключена в длинной (около 6 тысяч нуклеотидов) молекуле РНК [1]. Поскольку белки вируса ящура считываются с этой молекулы в виде единого полипептида, который потом разделяется на более короткие фрагменты протеазами, «геном» называется последовательность, которая кодирует белок с самостоятельными функциями. С РНК сначала считываются белки оболочки вируса, потом протеазы, а затем вирусные полимеразы, которые скопируют РНК вируса и с этих копий синтезируют много копий вирусного генома. РНК вируса можно представить в виде телеграммы, которая начинается со «здравствуйте» (одного стартового кодона) и где пропущены слова «ЗПТ» или «ТЧК» — между генами отдельных белков.
Я расскажу о небольшом — в 20 аминокислот — пептиде, который называется 2A.
«Ген» 2A расположен между генами белков оболочки и полимеразами. 20 аминокислот, составляющие 2A, на первый взгляд, не играют никакой роли в воспроизводстве вируса. 2A не участвует в образовании белковой оболочки вирусных частиц и не попадает внутрь ее. Не принимает он участия и в образовании копий нуклеиновой кислоты. Однако у этих 20 аминокислот есть уникальное свойство.
Если ген, кодирующий 2A, вставить в середине какого-либо гена или между двумя генами любых белков, синтезировать соответствующую мРНК и поместить её в любую клетку с ядром или полученный из неё клеточный экстракт, рибосомы этой клетки начинают выпускать довольно странную продукцию. Это будет не один белок с лишними 20 аминокислотами в середине, как это произошло бы с любыми другими 20 аминокислотами, а два отдельных белка. Первый будет оканчиваться 19-ю аминокислотами от 2A справа (на C-конце), а второй всегда будет начинаться с пролина — последней (20-й) аминокислоты 2A (рис. 3).
Рисунок 3. Схематическое действие 2A на синтез белка. «Нормальный синтез» — с одной РНК считывается она полипетидная цепь. При синтезе белков вируса ящура, когда 2A наиболее эффективен, этот продукт не образуется, но при использовании ровно 20 аминокислот этот продукт можно увидеть. 2) Образуется два независимых белка, причем 2A прикреплен к С-концу первого. Продукт «нормального синтеза» никогда не превращается в два независимых полипептида (то есть, это не автокаталитическое расщепление).
Механизм
А ведь белки способны на самомодификацию — не только «саморазрезание», но и «самовырезание» фрагментов из середины: «Белки против РНК — кто первым придумал сплайсинг?» [5]. — Ред.
Первый намек на механизм действия 2A был получен в экспериментах на пекарских дрожжах — тех самых, которые производят хлеб, вино и пиво [2]. Кроме этой полезной деятельности, дрожжи используются во многих молекулярно-биологических экспериментах, поскольку, как и человеческие клетки, содержат ядро, и многие процессы в них протекают сходно. В то же время, дрожжи растут на более простых, а значит, более дешёвых средах, делятся гораздо быстрее человеческих клеток, и существуют масса возможностей генетических манипуляций с ними.
Одна из клеточных органелл, которые есть и у дрожжей, и у человека — эндоплазматический ретикулум (ЭР). Он состоит из окруженной двуслойной липидной мембраной сети каналов, по которым транспортируются различные вещества.
Белки, которые будут транспортироваться по ЭР, синтезируются рибосомами, прикрепляющимися к ЭР со стороны цитоплазмы через белок-рецептор. При этом синтезируемый белок из рибосомального тоннеля сразу поступает внутрь канала ЭР. Это свойство рибосом было использовано для проверки, не разрезает ли белки, содержащие 2A, какая-нибудь клеточная протеаза, потому что к белку, синтезируемому прикрепленной к ЭР рибосомой, у протеазы доступа нет.
Рисунок 4. Схема действия 2A при транспорте белков. Сигнальная последовательность на N-конце белка вызывает транспорт первого, но не второго белка в эндоплазматическую сеть. Условные обозначения: СП — сигнальная последовательность; ПАФ — проальфафактор; ЗФБ — зеленый флуоресцентный белок.
Если сигнальная последовательность, которая должна вызывать транспорт белка в эндоплазматическую сеть, была на первом гене, первый белок с прикрепленным к нему 2A транспортировался в ЭР, а второй белок оставался в цитоплазме. Если только второй белок содержал сигнальную последовательность, в ЭР транспортировался только он. Это означает, что:
Для проверки вероятного участия факторов теминации в реакции, вызываемой 2A, уже упоминавшийся ген-«склейка» ПАФ—2A—ЗФБ экспрессировали в дрожжевых клетках [3]. Оказалось, что в клетках, мутантных по факторам терминации ФТ1 или ФТ3, продукция большого числа молекул 2A приводит к гибели клеток, — вероятно, потому что факторы терминации не могут действовать эффективно на клеточных РНК в присутствие большого числа синтезируемых молекул 2A. Осаждение отдельных частей белка с помощью антител показало, что клетках, мутантных по ФТ1 или ФТ3, а также клетках, в которых образование прионов уменьшает количество активного ФТ3, образуется меньше двух продуктов реакции с 2A и больше — «нормального», не разрезанного, белка. Эти эксперименты показывают, что факторы терминации принимают участие в разделении синтезируемого белка с 2A надвое.
Одним из контрольных экспериментов для подтверждения этой гипотезы было воспроизведение реакции in vitro. В бесклеточных экстрактах было показано, что для прохождения реакции РНК, кодирующей 2A, достаточно было иметь все кодоны, включая кодирующий последнюю аминокислоту 2A, P19 [4]. В этом случае можно видеть, как пептид отделяется от последней тРНК. Последующие кодоны не нужны, то есть достаточно иметь кодон в последнем, А-сайте рибосомы, где обычно присоединяются факторы терминации.
К нашему удивлению, замена кодона для P19 стоп-кодоном привела к остановке реакции, то есть тРНК оставалась прикрепленной к пептиду. Очевидно, в случае «странного пептида 2A» конфигурация рибосомы позволяет факторам терминации либо узнавать стоп-кодон, либо выполнять свою обычную функцию: катализировать отделение тРНК от пептида.
Многие белки человека состоят из нескольких отдельных субъединиц (полипептидов), и для лечения некоторых заболеваний нужно экспрессировать все эти полипептиды одновременно, причем — в равной пропорции. Поскольку 2A предложено использовать в генной терапии для одновременного производства нескольких отдельных белков с одного вектора (вместо использования нескольких векторов), данные эксперименты поднимают пока неотвеченный вопрос о том, что произойдет с клетками человека, в которых 2A продуцируется долго и в больших количествах.
Второй вопрос еще менее изучен: каким образом рибосома остается прикрепленной к мРНК после терминации на 2A, и что позволяет ей начинать синтез второй части белка в отсутствие стартового AUG.